oio11

Генетическая трансформация животных

История вопроса: первые работы по генетической трансформации животных

Впервые о попытке трансформировать животное сообщил Benoit с соавторами (Benoit et al., 1957), описав фенотипическое изменение уток пекинской породы при введении им экзогенной ДНК интреперитонеально. Однако повторно подтвердить полученный положительный результат не удалось ни на утках этих же пород (Svoboda, Haskova, 1959), ни на других животных, в частности, крысах (Parry, Walker, 1958), мышах (Leuchtenberger et al., 1958) и тутовом шелкопряде (Астауров с соавт., 1960).

В 1974 г. Jaenisch и Mintz (Jaenisch, Mintz, 1974) впервые получили линию мышей, несущих чужеродный ген. Они описали схему эксперимента по введению чужеродной ДНК вируса SV40 в бластоцисты, которые помещали в матку специально подготовленных самок. Из таких эмбрионов развивались нормальные взрослые мыши, часть из которых содержала в своем геноме множественные копии ДНК вируса SV40.

В 1975 г. Mintz и Illmensee (Mintz, Illmensee, 1975) продемонстрировали возможность введения чужеродных генов в организм животного, используя клетки тератокарциномы (TCC) мыши, которые способны размножаться в культуре, а также терять свои неопластические свойства и нормально дифференцироваться после инъекции в эмбрионы мыши, находящиеся на стадии бластоцисты. Ранние эмбрионы, содержащие инъецированные TCC, способны развиваться во взрослых мышей, соматические и половые клетки которых мозаичны, так как являются смесью TCC и клеток с генотипом исходного эмбриона.

В 1980 г. Gordon с соавторами (Gordon et al., 1980) опубликовали первый отчет о получении трансгенной мыши путем микроинъекции в пронуслеус. Другая группа исследователей (Brinster et al., 1981) также предоставила сведения о стабильном включении чужеродной ДНК в геном мыши, с предположениями об эксперессии и наследовании этих генов. Gordon и Ruddle (Gordon & Ruddle, 1981) назвали этот процесс трансформации мышиного генома чужеродной ДНК путём микроинъекции в пронуклеус «трансгенным». А «трансгенное животное» они определили как животное, имеющее ген (или гены) стабильно включающийся в их геном с человеческим участием. Сам же участок двунитевой ДНК был назван «трансгеном».

Список литературы:

Астауров Б. Л., Беднякова Т. А., Гинзбург Г. И., Збарский И. Б., Раменская Г. П. Опыт получения наследственных изменений у тутового шелкопряда (Bombyx morih) посредством межлинейных инъекций дезоксирибонуклеиновой кислоты // Докл. АН СССР. 1960. Т. 134. № 6. С. 449 – 452.

Benoit J., Leroy P., Vendrely G., Vendrely R. Modifications de caracteres raciaux observees sur des canetions issus de canes et de canards Pekin prealablement soumis ades injection d’acide deoxyribonucleique de Canard Knaki // Compt. Rend. Acad. Sci. 1957. V. 245. P. 448 – 451.

Brinster R. L., Chen H. Y., Trumbauer M., Senear A. W., Warren R., Palmiter R. D. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs // Cell. 1981. V. 27. P. 223 – 231.

Gordon J. W. Gene Transfer in Mouse Eggs / Microinjection and Organelle Transplantation Techniques. Academic Press Inc. (London) Ltd., 1986. P. 351 – 370.

Gordon J. W., Ruddle F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei // Science. 1981. V. 214. P. 1244 – 1246.

Jaenisch R., Mintz B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 1250 – 1254.

Leuchtenberger C., Leuchtenberger R., Uyeki E. Cytological and cytochemical changes in liver of white mice following intraperitoneal injections of DNA preparations from breast cancers of agouti C3H mice // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1958. V. 44. P. 100 – 105.

Mintz B., Illmensee K. Normal genetically mosaic mice produced from malignant teratocarcinoma cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 3585 – 3589.

Parry T. L., Walker D. Failure of desoxyrubonucleic acid to affect somatic transformation in the rat // Proc. Soc. Exp. Biol., Med. 1958. V. 99. P. 717 – 720.

Svoboda J., Haskova V. Failure to produce somatic changes between strains of ducks of by means of specific DNA // Folia Biol. 1959. V. 5. P. 402 – 404.

[ в начало ]

Методы внедрения экзогенной ДНК

В настоящее время из разнообразных способов внедрения экзогенной ДНК в геном животных широкое применение в практике получили:

метод микроинъекции;
перенос генов ретровирусами;
перенос трансформированных ядер генеративных и соматических клеток;
использование спермиев и сперматогониев как переносчиков ДНК;
электропорация.

Каждый из подходов имеет свои достоинства и недостатки. Выбор того или иного метода зависит от цели конкретного исследования. К этому моменту не разработано универсального метода, который был бы оптимально эффективен для создания генетически модифицированных организмов, независимо от вида животных и от целей эксперимента.

Перенос генов с использованием ретровирусных векторов – достаточно результативный способ передачи ДНК в эмбриональные клетки. Ретровирусы – семейство эукариотических РНК-содержащих вирусов. Наиболее часто используются ретровирусные вектора на основе ретровирусов мыши типа C (вирус лейкемии мыши). Такие векторные системы состоят из двух компонентов: векторной конструкции и линии клеток-упаковщиц. В векторной конструкции (провирусная ДНК) гены, кодирующие структурные белки ретровируса (gag, pol, env), замещают интересующими генами. Источником структурных белков, необходимых для формирования новых инфекционных вирусных частиц, является клеточная линия, содержащая интегрированный в геном провирус.

Преимуществом применения такого подхода является тот факт, что до 100% обработанных эмбрионов могут быть успешно инфицированы ретровирусом. К недостаткам относят ограниченную емкость таких систем (размер вставки – не более 8 т.п.н.), а также возможное подавление экспрессии трансгенов и вероятность активации клеточных онкогенов (Эрнст, Зиновьева, 2002). Кроме того, ограничения на использование ретровирусных векторов накладывает их низкий титр (105 – 106 КОЕ/мл). Поэтому для успешной инфекции требуется культивировать эмбрионы, лишенные zona pellucida, в кондиционированных средах, содержащих ретровирус (Kim et al., 1993; цит. по: Эрнст, Зиновьева, 2002), либо микроинъецировать клетки, производящие ретровирус, в перивителлиновое пространство (Haskell, Bowen, 1995; цит. по: Эрнст, Зиновьева, 2002).

Другим способом получения трансгенных животных является использование трансформированных генными конструкциями клеточных линий. С этой целью могут быть использованы линии как стволовых, так и соматических клеток. Преимуществом этого подхода является возможность тестирования интеграции трансгена непосредственно в культуре клеток и возможность оценки экспрессии трансгенов (Эрнст, Зиновьева, 2002). Таким образом, можно получать только трансгенное потомство, отбирая для пересадки ядер (а следовательно, и для получения трансгенных животных) только те клеточные линии, в которых трансген транскрипционно и трансляционно активен.
В качестве природного вектора, доставляющего ДНК в клетки, могут быть использованы сперматозоиды (Lavitrano et al., 1989; Gandolfi, 1998; Эрнст, Зиновьева, 2002). Сперматозоиды могут поглощать экзогенную ДНК и аккумулировать её в ядре. Очевидным преимуществом является возможность использования сперматозоидов после криоконсервации и длительного культивирования. Однако, в настоящее время механизм интеграции экзогенной ДНК в геном сперматозоидов еще не установлен, а применение этого метода даже при использовании одинаковой схемы экспериментов может привести к противоречивым результатам.

Ещё одним способом внедрения экзогенной ДНК в клетки является метод электропорации, впервые примененный в 1982 г. Т. Вонгом и Е. Нейманом с сотрудниками. Суть подхода заключается в кратковременном (5 – 20 мс) воздействии электрического поля высокой напряженности (1 – 15 кВ/см) на бислойную липидную мембрану, что приводит к образованию в ней пор. Время существования и размер пор позволяют таким макромолекулам, как ДНК, войти в клетку под действием осмотических сил. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, а также концентрация экзогенной ДНК и количество клеток-реципиентов подбираются экспериментально. Электропорация является наиболее простым, эффективным и хорошо воспроизводимым методом введения молекул ДНК в клетки, но для трансформации оплодотворенных ооцитов мыши практически не используется (Щелкунов, 2004).

Классическим же методом трансформации животных является метод микроинъекции. Введение чужеродных генов в оплодотворенную яйцеклетку, несмотря на трудоемкость и сложность, является быстрой одноэтапной процедурой, обеспечивающей в случае интеграции экзогенной ДНК в геном эмбриона наличие донорских генов во всех соматических и зародышевых клетках особи. При этом результативной является микроинъекция в пронуклеус. Как показано многими исследователями, микроинъекция ДНК в цитоплазму не приводит к встраиванию конструкции в геном.

Таблица 1. Некоторые параметры яйцеклетки и последовательность событий в ходе формирования двуклеточного зародыша мыши (Krishna, Generoso, 1977; Hogan et al., 1986).

Диаметр яйцеклетки	85 мкм
Объем яйцеклетки	270 пкл
Объем пронуклеуса	1 пкл
Оплодотворение	1,5 – 2 ч *
Образование второго полярного тельца	2 – 5 ч **
Образование мужского и женского пронуклеусов	3 – 4 ч **
Начало репликации ДНК в пронуклеусах	8 ч **
Завершение синтеза ДНК	16 ч **
Первое деление дробления	17 – 20 ч **

Примечание:

* после спаривания;

** после оплодотворения яйцеклетки.

Список литературы:

Эрнст, Зиновьева, 2002

Krishna M., Generoso W. M. Timing of sperm penetration, pronuclear DNA synthesis, and first cleavage in naturally ovulated mouse eggs // J. Exp. Zool. 1977. V. 202. P. 245 – 252.

Hogan et al., 1986

[ в начало ]

Факторы, влияющие на эффективность трансгенеза

Одной из центральных задач, связанных с совершенствованием метода микроинъекции, является оптимизация условий с целью увеличения выхода трансгенного потомства. Степень интеграции (отношение числа трансгенных особей к общему числу родившихся особей) при использовании метода микроинъекции варьирует в незначительных пределах в зависимости от вида животных и у мышей составляет в среднем не более 15%. Общая эффективность трансгенеза (отношение числа полученных трансгенных особей к общему числу пересаженных эмбрионов) также характеризуется относительно постоянной величиной и у мышей составляет не более 2% (Brem et al., 1995; цит. по: Эрнст, Зиновьева, 2002).

Успех трансгенеза в общем случае зависит от того, насколько приближены условия извлечения эмбрионов, условия проведения процедуры микроинъекции и, если требуется, условия культивирования эмбриона к физиологически нормальным. Важную роль здесь играют как состав инъекционного буфера, с которым экзогенная ДНК вносится в пронуклеус, и среды для культивирования зародышей, так и сама методика микроинъекции. С другой стороны, буферные системы и культуральные среды должны быть подобраны таким образом, чтобы концентрации солей и pH были не только наиболее приближены к физиологическим значениям, но и облегчали (или хотя бы не затрудняли) доступ к зиготе (и к мужскому пронуклеусу зиготы). В частности, для рассеивания клеток кумулюса в среду вносится гиалуронидаза, однако после удаления кумулюсных масс необходимо отмыть эмбрионы от гиалуронидазы или каким-то образом инактивировать фермент. Кроме того, экзогенная выделенная ДНК перед инъецированием в пронуклеус должна быть подвергнута диализу в 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и 0,1 мМ ЭДТА (pH 7,5) (Gordon, 1986); эти компоненты, как правило, входят в состав инъекционного буфера.

Выход трансгенеза, очевидно, зависит не только от эффектов, обусловленных средой, но и от эффектов генетического фона. Поэтому следует внимательно отнестись и к выбору линии мышей (обзор линий лабораторных животных приведен в работе Auerbach et al., 2003).

Brinster с соавт. анализировал частоту интеграции экзогенной ДНК у мышей, пытаясь оптимизировать саму процедуру и условия проведения микроинъекции, подбирая оптимальную концентрацию, размер и форму вводимой ДНК, сайт инъекции, а также состав инъекционного буфера (Brinster et al., 1985). Как и ожидалось, инъекция большого количества ДНК оказалась токсичной. Наибольший же выход трансгенного потомства (не более 10%) наблюдался в случае инъецирования ДНК в концентрации 1,0 – 2,0 нг/мл (порядка 10^2 копий) с использованием инъекционного буфера, содержащего 0,1 – 0,3 мМ ЭДТА. Показано также, что частота интеграции экзогенной ДНК при инъекции в цитоплазму зигот, несмотря на меньшую травматичность метода, значительно ниже, чем при инъекции в пронуклеус. Кроме того, было отмечено, что производство трансгенных мышей при использовании гибридных линий происходит в 8 раз эффективнее, чем при использовании инбредных мышей C57BL/6, и сделан вывод о том, что выбор линии может влиять на выход трансгенеза.

Hirabayashi с соавт. (Hirabayashi et al., 2001) показали, что продуктивность трансгенеза зависит как от инъецируемой ДНК, так и от техники проведения процедуры, и от репродуктивных характеристик вида животного. Они сравнивали эффективность производства трансгенных животных, путем введения экзогенной ДНК в пронуклеус зигот мыши, крысы, кролика и свиньи. Для микроинъекций использовалась линейная конструкция размером 2,8 т. п. н., несущая ген бычьего alpha-S1-казеина и человеческого гормона роста в конечной концентрации 5 мкг/мл. Постинъекционная выживаемость зигот мыши (67,1%) была значительно ниже, чем у крысы, кролика и свиньи (89,6 – 100 %). Показана также относительно низкая конечная эффективность трансгенеза для мышей (0,8%), кроме того, очень высока доля неродившихся особей (72,6%). При этом авторы указывают на то, что выход трансгенного потомства у крыс значительно выше (4,8%), однако при работе с крысиными зиготами технические затруднения могут быть вызваны тем, что мембрана мужского пронуклеуса у них имеет достаточно высокую вязкость, а цитоплазматическая мембрана более стойкая.

Auerbach с соавт. (Auerbach et al., 2003) имели своей целью выявить ключевые характеристики нескольких линий мышей, достоверно влияющие на эффективность трансгенеза. Для анализа были взяты четыре линии животных: аутбредные SW, гибриды B6D2/F1, инбредные FVB/N и инбредные C67BL/6. Для инъецирования использовались только однонитевые фрагменты ДНК в концентрации 2 – 5 нг/мкл. Анализ трансгенного потомства показал, что наибольший выход (16,34%) наблюдается в случае инбредной линии FVB/N. В случае гибридной линии B6D2/F1 эффективность ниже (13,36%), и наименьший выход в случае инбредных линий SW (11,67%) и C57BL/6 (9,43%). Основными факторами, достоверно снижающими выживаемость эмбрионов в выборке, были признаны спонтанный лизис зигот вскоре после инъекции ДНК (с частотой 16 – 22 % в зависимости от линии мышей) и блок развития на стадии одной клетки (с частотой 4 – 18 % в зависимости от линии мышей).

Исходя из данных, приведенных выше, можно сказать, что конечная эффективность трансгенеза (отношение числа родившихся трансгенных особей к числу проинъецированных зигот) не превышает 16,34% и, очевидно, в значительной степени зависит от выбора линии самок-доноров. Оптимальный размер переносимой конструкции содержит порядка 10^3 п. н., инъекционный буфер должен содержать 10 – 100 мМ Tris-HCl и 0,1 – 0,3 мМ ЭДТА. Объем вносимого раствора ДНК должен определяться нормальным объемом мужского пронуклеуса и эластичностью его мембраны.

[ в начало ]

Анализ доимплантационных эмбрионов на трансгенность

Относительно низкая эффективность получения трансгенных животных является главной причиной поиска подходов, позволяющих выполнять анализ на трансгенность еще в доимплантационный период развития. Все используемые в настоящее время для этих целей методы можно разделить на два класса:

использование в генной конструкции репортерных генов с последующим определением их экспрессии (т.е. мРНК или белка репортерного гена) в эмбрионах,
определение наличия в эмбрионах самой ДНК генной конструкции.

Среди используемых репортерных генов наиболее известными являются: ген beta-галактозидазы E. coli (LacZ), ген люциферазы, ген щелочной фосфатазы, а также зеленый флюоресцирующий белок (GFP). Применение каждого из таких генов в качестве маркеров имеет свои достоинства и недостатки. В частности, определение beta-галактозидазы, как правило, требует фиксации эмбриона, а необходимость получения экстракта тестируемых клеток или введение люциферина непосредственно в ткани ограничивает применение люциферазы на эмбрионах.

Для определения трансгенности эмбрионов широкое применение нашел метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).Однако стоит помнить о том, что в действительности достоверные способы определения трансгенности связаны, как минимум, с рождением предположительно трансгенных животных. Ни один из методов определения трансгена на ранних стадиях не дает прямого ответа на вопрос, прошла ли интеграция экзогенной ДНК в геном, или же генетическая конструкция находится во внехромосомной форме. Поэтому в случае определения экзогенной ДНК на доимплантационных стадиях следует учитывать ряд допущений. Например, при использовании метода ПЦР следует помнить, что (1) не все копии экзогенной ДНК попадают в пронуклеус и остаются в ядре, (2) не все копии, попавшие в пронуклеус, интегрируют в геном, и (3) не все копии, не интегрировавшие в геном, элиминируются нуклеазами к моменту приготовления препарата ДНК.

[ в начало ]

Применение трансгенных животных

(по материалам сайта http://www.humbio.ru/)

Трансгенные животные особенно важны для изучения цис-элементов, которые контролируют тканевую специфичность и онтогенетические особенности экспрессии генов. Предполагаемые цис-элементы соединяют с геном-репортером, который кодирует легко выявляемый продукт. С помощью этого подхода показано, что высокую тканевую специфичность экспрессии гена инсулина и гена эластазы обеспечивают короткие последовательности ДНК, а экспрессию генов глобина контролируют более сложные и более удаленные от этих генов регуляторные последовательности.

Трансгенных животных с введенными вирусными или клеточными онкогенами используют для изучения канцерогенеза. Например, тканеспецифичный цис-элемент, сцепленный с геном большого Т-антигена вируса SV40, вызывает канцерогенез в некоторых типах клеток. Аналогично цис-элемент можно соединить с геном токсина и добиться избирательного поражения клеток. Так, введение мышам гена дифтерийного токсина, соединенного с цис-элементами гена инсулина, позволяет получить мышей, у которых отсутствуют бета-клетки поджелудочной железы.

Дополнительные возможности открывает метод гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках мыши. Эти полипотентные клетки можно выделить, модифицировать в культуре и ввести обратно в эмбрионы мыши. Метод позволяет вызвать мутацию нужного гена или инактивировать его. Модифицированные таким образом эмбриональные стволовые клетки вводят в бластоцисты, из которых развиваются химерные животные, то есть животные, у которых некоторые клетки являются мутантными. Мутантные клетки часто присутствуют в сперме химерных животных, что позволяет получить линию мутантных мышей и исследовать нужный ген у гетерозигот и гомозигот. С помощью этого метода у мышей созданы модели ретинобластомы , синдрома Ли-Фраумени (мутация гена-супрессора опухолевого роста ТР53), муковисцидоза , синдрома Леша-Найхана , болезни Гоше , недостаточности апопротеина Е и других заболеваний.

Возможность получения мышей, мутантных по любому клонированному гену, позволяет исследовать функцию генов. Иногда мутация проявляется по-разному у мышей и у человека, что дает возможность исследовать особенности биологии организмов. Если же мутация проявляется сходным образом, то мутантные мыши представляют удобную модель для изучения патогенеза болезни и методов ее лечения. Мутантных мышей используют для установления роли наследственных факторов в развитии полигенных болезней, например атеросклероза, и для исследования функции нервной системы.

Крупных трансгенных животных используют для производства препаратов, которые выделяют из молока или крови.
http://www.transgene.ru/ru/transformation.html